供血供应的减少和供血成本的增加促使人们研究新的血红蛋白基氧载体(HBOCs)，以替代红细胞(RBC)。hboc是一种多用途药物，可用于治疗失血性休克。然而，许多基于哺乳动物血红蛋白的红细胞替代品存在着不稳定性和毒性等关键局限性。相比之下，促红细胞生成素(Ecs)是其他类型的hboc，可能不会遭受这些缺点。Ecs是一种巨大的金属蛋白，存在于环节动物、甲壳类动物和其他一些无脊椎动物中。迄今为止，陆生蚓(Lumbricus terrestris, LtEc)和沙蚕(Arenicola marina, AmEc)的Ecs研究最为深入。根据临床前输血研究的数据，发现这些化合物不仅有效地运输氧气和具有抗炎特性，而且还可以进行修饰以进一步提高其有效性。本文综述了Ecs的结构、性质、应用及其相对于其他hboc的优势。发展稳定和纯化红血球蛋白的方法可以增加获得人工血液资源的机会。
输血是一种标准的程序，允许替换缺失的血液成分。该程序最初的问题与供体的可用性有关[1,2]，特别是对于罕见血型的个体。据统计，普通人群中只有7%的献血者是通用血型(O型血和Rh阴性组)[3]。其次，老龄化社会可能导致10-20年内潜在捐赠者减少[4]。第三个问题是，由于对寨卡病毒或人类免疫缺陷病毒(HIV)等血源性病毒的筛查扩大，献血者采血费用不断上升[1]。最后，需要注意的是，红细胞的半衰期有限(在冷藏条件下为42天)[2,3,5]，并且在48小时后会发生明显的储存损伤(例如，红细胞膜硬化或细胞内血红蛋白氧化)[6]。迫切需要增加红细胞代用品的使用，也称为人工氧载体，可用于突然或意外失血的创伤患者[7]。它们为以缺氧为特征的疾病提供了氧气治疗的可能性[1,3,5]。此外，无细胞红细胞替代品可以解决血型匹配问题[8]，这将有利于手术或癌症化疗[7,9,10]。对包括肝脏或肾脏在内的各种器官的研究表明，血红蛋白基氧载体(HBOCs)也可用于适合移植的器官的再灌注和维持[11,12,13]。本文利用PubMed、Science Direct和Web of Science数据库，以“红细胞替代品”、“血红蛋白”、“红细胞”、“人工氧载体”为关键词，回顾了2000年至今发表的与红细胞替代品相关的数据，重点介绍了一种很有前途的人工氧载体，即“红细胞红素”。
了解红细胞代用品的作用机制对其临床应用至关重要。血红蛋白是红细胞中发现的一种四聚体蛋白，是其特有的红色的组成部分[14]。由于血红蛋白的存在，红细胞可以结合肺部的氧气并将其运送到其他组织/器官。这种蛋白质也允许二氧化碳的运输(大约1。30%)与来自组织和器官的细胞代谢产物在相反方向。此外，血红蛋白被称为蛋白质缓冲液，因为它能维持血浆的适当pH值。Hb由两条α和两条β多肽链组成[14,15]。它们每一种都有一个含铁离子的血红素基团。一个血红素基团可以结合一个O2分子，这使得一个Hb分子可以携带4个O2分子[5]。
氧是一种不可替代的元素，在细胞能量中起着至关重要的作用[16]。氧气从环境(大气空气)中获得，并通过红细胞内的Hb通过呼吸道输送到肺部。图1A描绘了一个简化的图形表示。除了在氧气和二氧化碳运输中的作用外，血红蛋白还能解毒活性氧(ROS)和一些氮化合物[17]。氧饱和度取决于氧与血红蛋白的结合和从四聚体中释放这种化学元素之间的平衡。它还取决于许多因素，如温度、pH、pCO2(二氧化碳分压)、氧张力和2,3-二磷酸甘油酸(DPG)的浓度，后者是一种稳定血红蛋白低氧亲和形式的变容效应物[18]。血红蛋白的多亚基四级结构影响氧亲和力[19]。在血液从肺流向组织的过程中，即使氧分压(pO2)的微小变化也会极大地影响血红蛋白的氧结合或释放。氧平衡曲线的经典s型曲线证实了这一点，该曲线与血红蛋白在一定氧压范围内的氧饱和度有关。在健康成人中，~27 mmHg的氧分压对应50%的血红蛋白饱和度(P50)。曲线的右移表明血红蛋白对氧的亲和力降低。左移表明血红蛋白对氧的亲和力增加，不愿释放氧气。(图1B)[20]。氧分子与HbA的结合增加了剩余结合位点的亲和力，但一旦第一个O2被释放，剩余珠蛋白的氧亲和力就会显著下降，这导致剩余氧的快速释放，但这只有在血红蛋白到达氧分压相对较低的组织后才会发生[14,19]。在每个血红素群中，氧分子与还原铁原子(Fe2+)的结合产生氧合血红蛋白，称为氧合血红蛋白，将氧气从肺部运输到组织。值得一提的是，血红蛋白具有高度的构象变化倾向，这有助于肺内氧的饱和及其在靶组织中的释放(氧合血红蛋白转化为脱氧血红蛋白)。这些变化是可逆的，并得到2,3-二磷酸甘油三酯和其他变构效应分子(如六磷酸肌醇和贝扎布酸)的辅助[14]。然而，在保护性完整的红细胞环境之外(即在无细胞环境中)，血红蛋白四聚体容易迅速分解成蛋白质亚基，缺乏2,3-二磷酸甘油、高铁血红蛋白还原酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等调节分子。这导致组织氧合降低，Hb转化为高铁血红蛋白(metHb)的可能性降低[10,14]。
图1
血红蛋白的氧运输取决于许多因素。Hb输运O2的简化方案。重点放在单个血红蛋白四聚体中血红素基团的数量上，因此许多氧分子结合并释放到各种组织的细胞中。B氧-血红蛋白解离曲线。使用BioRender和Inkscape创建的图
以前的RBC替代品分为三大类:全氟碳(PFC)乳剂、脂质或聚合物封装的哺乳动物血红蛋白、聚合或交联的哺乳动物血红蛋白[14]。PFC乳剂是线性、环状或多环碳氢化合物，其中氟原子取代氢;这些化合物与水高度不相容[1,21]，但毒性极强，不能以可控的方式提供氧气[22]。多年来，开发了几代hboc。最初生成的hboc由没有红细胞膜的Hb组成，并已显示出发热、肾毒性、组织灌注减少甚至肾功能衰竭等副作用[1,22]。这促使第二代hboc的产生，通过将Hb与醛聚合以降低肾毒性的风险。不幸的是，它的临床试验显示了另外两个显著的副作用，即氧化应激和一氧化氮清除。
如式1所示，结合氧可以促进血红素铁氧化为Fe3+，生成超氧化物(O2?)，对组织造成氧化损伤[23]。此外，氧化后的血红蛋白由于无法结合O2而缺乏O2可转运性特征[24,25,26,27]。
（1） (2)
血红蛋白也可以被气态激素一氧化氮(NO)氧化，一氧化氮由细胞释放到血液中以控制血管张力。如式2所示，NO还能与结合在血红蛋白上的氧反应生成硝酸盐(NO3?)，同时也能氧化血红素铁。此外，通过这一过程消除NO会导致血管收缩，从而导致高血压等危险的副作用[28,29]。因此，临床试验已于2011年停止[30]，所列多氯联苯均未被美国食品和药物管理局(FDA)或欧洲药品管理局批准普遍使用[15,31,32,33,34,35,36]。
第三代基于血红蛋白的氧载体可分为化学修饰和封装的HBOC系统[14]。然而，脂质体包裹的血红蛋白在储存几天后显示出聚集的趋势[37]。相比之下，KaloCyte公司构建了一种纳米封装的人血红蛋白ErythroMer，其与O2和一氧化氮的相互作用类似于红细胞[38]。这种载体的显著优点是能够结合并释放氧分子而不收缩血管，但它只有在溶解一段短时间后才稳定。然而，对ErythroMer的体内研究较少，该载体尚未在人体临床试验中进行评估[14,39]。目前，研究进展最大的是改性血红蛋白，如多血红蛋白(polyHb)或Hb与纤维蛋白原以多血红蛋白-纤维蛋白原复合物的形式组合[1]。
hboc的化学修饰包括血红蛋白交联(分子内或分子间)、表面修饰(如聚乙二醇偶联)或聚合(如与相关氧化还原酶)。这些类型的红细胞替代品包括，例如，polyhemoglobin, polyhb - fibrin原，Sangart的haemspan产品和Baxter的HemAssist[14]。多血红蛋白是最早在创伤性大量失血和各种手术患者中显示出治疗效果的hboc之一[18]。另一个例子是多hb -纤维蛋白原，它不仅在补充红细胞，而且在补充血小板和凝血因子方面发挥重要作用，使其能够作为具有血小板样活性的氧载体[18,40]。另一方面，Sangart的haemspan产品是通过使用聚乙二醇(PEG)的大聚体生物偶联产生的红细胞替代品的例子，这可以增加其在血管中的稳定性和停留时间。临床试验结果显示，危及生命的心动过缓的风险增加，而且低剂量给药与肝脏和胰腺酶水平升高有关[41,42,43]。另一种红细胞替代品HemAssist是用富马酸双-(3,5-二溴水杨酸)酰化血红蛋白生产的，但由于患者死亡率增加，未能通过临床试验[44]。当涉及到封装的HBOC系统时，这些替代品是将血红蛋白包裹在合适的颗粒载体中，如胶体(硝酸纤维素)或可生物降解的聚乙二醇聚乳酸(PEG-PLA)[14]。这种类型的HBOC利用牛和人血红蛋白，包括产生聚合体封装的Hb (PEH)，尽管相关的体内研究迄今为止有限[39]。值得注意的是，所有封装的HBOC系统的体内和体外研究都在进行中[14]。
一种有吸引力的替代先前hboc的方法是一种叫做红细胞红蛋白(Ec)的金属蛋白——一种在环节动物和甲壳类动物中发现的红色呼吸色素[45]。Ec具有几个优点，有利于其作为红细胞替代品的潜在用途。例如，研究表明，与成人血红蛋白(HbA)相比，地蚓的Ec高度稳定，不易氧化，并且可能以与哺乳动物血红蛋白不同的方式与NO相互作用[46]。接下来的章节提供了更详细的红细胞生成蛋白的描述。
红蛋白存在于大多数环节动物、一些软体动物和生活在各种环境中的昆虫中。尽管大多数红蛋白出现在生活在相对温和或寒冷温度下的海洋环节动物中，但在极端微生物中也发现了红蛋白，如多毛体Alvinella pompejana蠕虫，它们占据高温热喷口，因为它们可以在极低氧气的极端条件下生存[25]。不幸的是，难以获得一些含ec的极端微生物限制了对这些非典型氧载体的研究[25]。
不同类型的Ecs具有不同的形状和大小，但它们的结构是相似的，根据电子显微镜数据，这些由180-198个亚基组成的大型细胞外多聚蛋白以六边形双层(HBLs)的形式可见，形成具有D6对称的双层结构[36,47,48,49,50]。每个HBL包含五种不同的Hb链(A, B, C, D1和/或D2)的多个拷贝，这些链组装成十二聚体(例如，A3B3C3D3)，这些十二聚体由四种非血红蛋白连接体(L1, L2, L3和L4)的三聚体结合，这些三聚体将球蛋白组装成HBL。此外，这些亚基都被分子内和分子间的共价二硫键以及强静电或疏水力稳定，从而防止了在哺乳动物血红蛋白中观察到的解离[48,51]。Ecs的分子量约为3.6×106 Da，沉降常数约为60S。许多环节动物和节肢动物的内皮细胞不是被包装在细胞中，而是自由地溶解在血液中。尽管Ecs和哺乳动物Hb在结构上存在显著差异，但Ecs以变构方式结合和释放氧气，这与图1所示的氧平衡曲线高度相似。然而，一些来自海洋蠕虫的Ecs往往对O2具有类似的高亲和力，例如，对来自Lumbricus terrestris的Ecs具有~28 mmHg的亲和力[47,51]。
内皮细胞的特征因其来源的生物体而异。其中一些Ecs具有高氧亲和力(例如Branchipolynoe symmytilda的Ecs, P50=0.9-1.4 mmHg或Megascolides australis的Ecs, P50=2 mmHg)，而其他Ecs被称为chlorocruorins(例如Eudistylia vancouverii的Ecs, P50=145mmHg和Potamilla leptochaeta的Ecs, P50=155mmHg)，其特点是由于修饰的血红素基团(卟啉环第2位的乙烯基被甲酰基取代)而具有低氧亲和力[14,52,53]。相比之下，Glossocolex paulistus Ec (GpEc)和Lumbricus terrestris (LtEc, P50=28 mmHg)等陆生蠕虫的Ecs具有更温和的氧亲和力，类似于人类全血[46,54,55]。接下来的段落描述了研究最深入的红蛋白的结构和生物物理特性，它们起源于两种生物(陆地蚓和沙尼科拉)，代表了第一和第二种红蛋白，它们在一些物理化学特性上可能有所不同(表1)。
表1各种促红细胞生成素的性质概述
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蚯蚓被认为原产于西欧，但它现在全球分布在温带到温和的北方气候。LtEc由180个多肽链组成，其中包括144个珠蛋白亚基和36个连接链[62]。每个珠蛋白亚基包含一个分子内二硫键和一个氧结合血红素基团。红细胞红素中血红素基氧结合位点的数量见表1。有趣的是，与哺乳动物Hb亚基相比，这种珠蛋白的结构更类似于肌红蛋白[46]。LtEc的组装始于A、B和C珠蛋白，它们形成分子间二硫键，形成共价连接的ABC三聚体(图2)。反过来，ABC三聚体和D单体(D1或D2)通过静电和疏水相互作用自结合，形成ABCD四聚体[54]。六方双分子层由二硫键连接的三聚体形成，三聚体由珠蛋白D和珠蛋白A、B和C链的单体链连接到血红素缺乏的连接链上。由于连接链的存在，形成完整的六方LtEc结构是可能的，这些连接链也被分子内二硫化桥稳定。这三条连接链自组装形成连接三聚体(三股螺旋状线圈)，在三聚体形成过程中，可能有L1-L4连接链的几种组合。三个连接链存在于1/12个单位中，每个连接链为观察到的螺旋线圈提供一个长氨基末端螺旋。这些连接体三聚体中的12个产生了指向复合物中心的三股螺旋线圈的“辐条”。由此产生的复合物是一个关键的稳定元素，也是12个血红蛋白十二聚体的支架[46,51,63]。此外，LtEc也被几个Ca2+结合位点稳定。
图2
地蚓属红血球蛋白。图中显示了LtEc的两种不同取向:沿分子六重轴(中心)和水平旋转90°以强调六边形双层(右)。十二聚体、连接体和原聚体是高亮显示的。人类血红蛋白被显示为大小的参考。从蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)中获取结构，并使用ChimeraX v1.3进行可视化。整个LtEc分子、LtEc原聚体和人Hb的PDB分别为4V93、5M3L和2hbb
滨沙藻是一种生活在富含硫化物环境的潮汐区，环境条件波动频繁的生物[64]。AmEc具有一般的D6对称性，由198条多肽链组成，其中包括156条珠蛋白链和42条连接链[36]。血红蛋白亚基形成分子的表面，而连接子亚基负责核心的形成。AmEc亚基的排列与LtEc非常相似[47];然而，也有一些关键的区别。虽然血红蛋白十二聚体的结构在LtEc和AmEc中是一致的，但由于36个连接亚基分布在这些Ecs的核心，这些十二聚体在两个复合物中的排列是不同的。在I型红细胞蛋白(如LtEc)中，两个六角形层的顶点部分移位，其中一层与另一层之间约移位16°。对于类型II(例如AmEc)，顶点基本上是重叠的[65]。此外，I型红细胞红蛋白的结构比II型红细胞红蛋白结构更紧凑，已列入表1。这是因为在I型中(原聚物)的三股盘绕线圈被分解成更长的(大约。45?)和更短(大约。20?)螺旋式线圈，连接断开，而II型的特点是连续的~70?螺旋式线圈[47]。表2总结了Ecs与传统hboc的比较，并将在后续章节中多次引用。
表2与传统方法比较处在于部分
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由于其结构和功能特性，红细胞红素是一种很有前途的红细胞替代品，多年来一直在啮齿动物中进行临床前输血研究[78,81,82]。脱氧后的LtEc可以在37℃下保存至少7天而不丧失其功能，这与必须连续冷藏的捐献红细胞相比是一个显著的改进(表1)[78]。这对军事行动或在第三世界国家极为有利。向实验动物(主要是小鼠和大鼠)注射少量LtEc和AmEc的各种实验表明，这些化合物在啮齿类动物体内似乎不会产生副作用;然而，只研究了几个参数[65,81]。LtEc的半衰期约为14小时(与半衰期约为19小时的hboc相似)，比红细胞(月)短，因此值得注意的是，它不能提供相同的持续氧转运(表1)[63,64,79]。然而，Teruyuki Komatsu小组的工作深入了解了血红蛋白-白蛋白簇作为红细胞替代品，并显示了新一代HBOC相对于Ecs的优势。该科学小组的研究表明，HbBv-HSA3簇具有足够的临床前安全性，可作为红细胞输血的潜在替代材料，其循环半衰期为18.5小时[80]。体外实验还表明，接触珠蛋白不能清除AmEc，而接触珠蛋白是一种与游离HbA强结合并将其从血液中清除的血清蛋白[46]。AmEc、LtEc和HbA的循环半衰期见表2。然而，从老化或受损的红细胞中释放的无细胞血红蛋白解离成二聚体，其半衰期仅为几个小时[13]。由于Ecs具有更大的结构，它们的快速肾脏摄取可能会被阻止，使其半衰期更长，特别是如果它们与戊二醛交联[66]，尽管确切的机制尚不清楚。
关于LtEc，有研究表明，多次向仓鼠注射红血球蛋白不会引发免疫反应，这是通过检测IgE和IgG2抗体来确定的[65]。此外，我们观察到LtEc引起轻微的血管舒张，而不是其他hboc引起的血管收缩(表2)[46]。这表明，由于血红素口袋内天然存在的苯丙氨酸和色氨酸残基等氨基酸，LtEc可能显著减少了一氧化氮的双氧作用。这是Ecs相对于HbA的一个非常重要的优势，因为这意味着LtEc可以避免在以前的血液替代品中观察到的血压升高和全身性高血压[46]。在仓鼠中进行的其他实验表明，LtEc可以有效地维持全身血流动力学，保持血气参数，并输送氧气，从而防止由极端贫血(11%血细胞压积)引起的组织缺氧。与其他等离子体膨胀剂相比，LtEc具有分子大小大、氧结合特性好、粘度高、稳定性好、循环半衰期长等优点，具有更好的氧输送能力[77]。与人类全血标准(19-24.5 mmHg)相比，LtEc的肿瘤压略有降低。肿瘤压力很重要，因为它决定了体内液体运动的方向;因此，溶剂中离子和蛋白质的相对浓度[70]。表2描述了体内输血后的稳定性和毒性，并将其与hboc进行了比较。Hirsch等人的研究表明，LtEc可以安全地输注到大鼠和小鼠体内，不会与血浆组分发生有害的相互作用[81]。关于LtEc的大型项目，至少有一个正在进行中(ID: 1R15HL133880-01A1)，基于美国国立卫生研究院(reporter.nih.gov)。
与LtEc一样，AmEc已成功输注到啮齿动物体内，并未引起免疫反应或血压变化[25]。一项研究表明，输注到小鼠体内并没有导致这些动物的一般行为或生长发生任何变化[65]。与LtEc相反，当暴露于人体血浆中的低离子强度时，AmEc从六方双分子层解离成十二分子层的速度很快。尽管如此，LtEc和AmEc输注已被证明对维持啮齿动物的氧气输送有效[25,65,77,81]。AmEc潜在的抗炎、抗菌和抗氧化特性也已被证实。表1列出了所有这些潜在的属性。在灌注条件下，这种氧载体也可作为移植物或器官(如心、肝、肺或肾)的添加剂的保存溶液[36,57,58,59]。此外，研究表明，AmEc可能是牙周伤口愈合和再生的潜在治疗剂[83]。Dare等人最近的一项体外研究证明，在基于细胞的肝脏模型中，AmEc在减少amanitin诱导的毒性方面具有积极作用。α-和β-amanitin对人肝癌细胞株HepaRG的活性有明显的促进作用，并能恢复HepaRG细胞的活性，减少线粒体ROS的产生。AmEc的肝保护作用可归因于该化合物输送氧气的能力[84]。反过来，Batool等人的研究结果显示了AmEc的抗炎和抗微生物潜力;经AmEc处理的口腔上皮细胞未见细胞毒性迹象。该血红蛋白可降低P. gingivalis脂多糖刺激和P. gingivalis感染的内皮细胞中促炎标志物(如肿瘤坏死因子α [TNF-α]、核因子κB [NF-κΒ]和NF-κB配体受体激活剂[RANKL])的水平或增加愈合介质(如血小板源性生长因子异构体BB [PDGF-BB]、转化生长因子β1 [TGF-β1]、白细胞介素-10 [IL-10])和免疫调节剂的水平。治疗减少了炎症细胞浸润(ICI)，改善了骨愈合。此外，该化合物对牙龈卟啉菌生物膜的形成具有抗菌活性，并能减少细菌的生长[83]。来自美国国立卫生研究院(clinicaltrials.gov)的临床试验数据显示，一项正在招募的3期试验(标识符:NCT04181710)评估了一种基于amec的医疗解决方案(称为haem2life?)的有效性。该设备是一种用于器官保存的氧合溶液，最近获得了CE标志，证明了其在安全性和临床效益方面的质量符合欧盟法规[85]。Hemarina-M101是从沙nicola marina血液中开发的一种新型无毒治疗氧载体。需要较低的分压才能使一些典型的o2结合部位与血液饱和，从而使氧气仅释放到缺氧细胞中。这种载体的优点是无免疫原性，操作温度范围广(4-37℃)，并且由于超氧化物歧化酶的活性而具有抗氧化特性[65]。最近的体内研究也表明，对心率或平均动脉压没有影响，也没有降低一氧化氮的结合特性[60]。研究结果表明，Hemarina-M101可能对移植后的缺血再灌注损伤具有重要的保护作用[60]。
除了红血球蛋白，还有两种主要的在医学上有益的氧结合蛋白值得一提:血青苷(hemocyanins, Hcs)和血红蛋白(Hrs)[45,86]。对于前者，可以区分出两个主要的超科，即节肢动物Hcs和软体动物Hcs，它们在结构外观上有所不同。目前，由于具有很高的治疗潜力，Hcs正处于各个方向的研究中，包括用作生物佐剂、免疫刺激剂和疫苗[45,87,88]。在体内进行的研究中，Hcs也显示出积极的结果。根据其在大鼠体内模型中的生化和免疫学特性，Hrs的行为方式与血红蛋白相似，这使其成为另一个有前景的研究方向[89]。
许多基于血红蛋白的氧载体在体内输血后具有严重的生物物理限制和严重的副作用。其中之一是高血管渗透胁迫产生的蛋白质不稳定。第二个负面方面是由于血红素氧化率高[34,56,69]和一氧化氮的去除，这些化合物的毒性[90]。后者是由双氧合引起的，直接导致促炎条件和血管收缩引起的心血管问题[3,91]。另一方面，氧结合血红素的自氧化威胁到能够产生具有促炎潜力的ROS的metHb的形成。这些缺点可以在从哺乳动物身上去除红细胞并将其用于生成hboc后观察到。因此，来自缺乏红细胞的生物体的细胞外血红蛋白(如红细胞红蛋白)可能是红细胞替代的更好来源[46,56]。
事实上，与大多数血红蛋白不同，红细胞红蛋白可以自由地溶解在环节动物的血液中，这无疑是一个优势。此外，Ecs由于其结构和功能特征，能够抵抗恶劣条件[46,48]。红血球蛋白另一个不可或缺的结构特征是共价二硫键的存在以及将它们结合在一起的静电或疏水力。与哺乳动物血红蛋白不同，分子间二硫键的存在降低了Ecs在低浓度下解离的易感性[46]。此外，与Hb相比，Ec的结构具有更好的结合能力;红细胞红蛋白具有许多血红素基氧转运位点。例如，每个LtEc分子含有144个氧结合血红素，而HbA只有4个[56]。此外，ec具有很高的氧化还原电位，其数值如表2所示[27];这影响血红素减少和形成铁血红蛋白的倾向。这也有助于它们自然产生的高稳定性和低毒性[77]。降低毒性是由于这些红细胞替代品具有抗氧化性，并且不能如此大程度地去除NO。后一个特征源于这样一个事实，即与其他hboc相比，Ecs具有更小的血红素口袋，这阻止了O2和NO的同时结合，因此无法形成硝酸盐[56,70,78]。通常使用希尔系数(n)[92]测量的另一个方面是协同性，通常与前面在引言中提到的氧亲和性一起描述。第一个O2的结合导致氧亲和力逐渐增加，直到所有Hb结合位点以合作的方式被填充[93]。Hill系数n>1表示正协同性(亚基之间的变构相互作用)，n=1表示非协同性O2结合[25]。当第一个配体分子结合后，酶对后续配体的亲和力降低时，可以观察到负协同性(n<1)。文献中有一些令人鼓舞的数据，表明LtEc相对于HbA具有更高的协同性(n=3.74 vs. n=2.43)[70]。与此同时，LtEc的Hill系数最高，分别为羊腹草(Amynthas gracilis) (AgEc, n=2.16)、Eudrilus eugenae (EeEc, n=1.96)、羊Eisenia fetida (EfEc, n=2.39)、hortensis (EhEc, n=1.97)、veneta (EvEc, n=2.13)[25]。对于传统的hboc，对天然Hb进行一些修饰会显著降低协同性[94]。
红细胞生成素的另一个优点与多年来实施的许多修改有关，允许生产具有增强稳定性的产品。迄今为止，用于纯化这些细胞外血红蛋白的主要方法是切向流过滤(TFF)、阴离子交换纯化(AEX)和固定化金属亲和层析(IMAC)[55]。TFF包括使用过滤器分离或隔离特定大小的颗粒。滤液被排出，产生压差，样品平行于过滤器流动，并多次再循环。使用TFF，纯化的Ec产量高，具有良好的生物物理特性，输注实验动物无副作用[55,70]。基于表面电荷分离蛋白质的AEX方法比基于氨基酸与金属相互作用的IMAC方法更适合于Ecs的纯化，因为后者会导致Ecs的氧化和解离[73]。尽管用TFF等方法纯化的Ecs可能不是100%纯的，但它们已经被安全地输注到动物体内，没有杂质引起的副作用[70]。如上所述，红血球蛋白是相对稳定的蛋白质;然而，为了提高它们作为红细胞替代品的有效性，应该改进它们在长时间储存中对高温的抵抗力。Spivack等人的一项研究表明，Ec与聚丙烯酸(PAA)和乙二胺(EDA)交联可以增强这种血红蛋白的稳定性，同时保持其天然的氧运输能力，甚至增加其对氧的亲和力[95]。与PEG偶联可以延长LtEc在循环中的半衰期(比未聚乙二醇化的LtEc长4倍)。然而，这种方法导致该化合物在体内氧化更快，从表2的协同性值(Hill系数)可以看出[68]。另一方面,共价交联的LtEc戊二醛(gLtEc)导致增加的熔点(从最初的Tm=57°C到Tm=68°C, glutaraldehyde-to-heme比例是128:1)和减少子单元的分离碱性博士此外,LtEc修改使用这种方法还能够运输氧气,高亲和力的化学元素,只有轻微的氧化速率增加[66]。值得一提的是，LtEc和AmEc均已成功冻干和重悬[23,96]。表2总结了红血球蛋白与传统hboc的比较，其中可以看到Ecs的氧化速率以及这些化合物的修饰目标和结果。
摘要
新型红细胞替代品的开发动机
结论
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随着血液供应的减少和价格的上涨，对红细胞替代品的需求是毋庸置疑的。人工氧载体是一种多用途的药物，可用于创伤和移植患者的失血。了解血红蛋白的作用机制是至关重要的，因为hboc使用这种蛋白质携带氧气。许多不同的红细胞替代品的有效性已经被测试过。然而，输血后，它们中的很大一部分出现了关键的局限性，如蛋白质不稳定和由于NO清除和氧化高铁血红蛋白而产生的毒性。使用红血球蛋白可能有助于克服这些限制。因此，这种金属蛋白可以被认为是一种很有前途的红细胞替代品。主要研究重点为从地蚓和沙蚕中提取的红血球蛋白。这些红血球蛋白表现出不同的结构特征，决定了它们的性质;然而，两者都可以用作氧载体。纯化方法(TFF、AEX、IMAC)和稳定方法(PEGylation、PAA和EDA交联)的发展可以使这些大分子结构在临床中使用，从而增加对人工红细胞资源的可及性。
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