癌症干细胞(CSCs)被认为在癌症的发生、进展和复发中起着至关重要的作用。干细胞也被认为对癌症治疗更有抵抗力。然而，CSCs与免疫微环境之间的相互作用是复杂的，尚未完全了解。在目前的研究中，我们使用单细胞RNA序列(scRNA-Seq，公共数据集)技术来鉴定csc的特征。我们发现肺腺癌癌干群体具有高度炎症性，并通过分泌炎症因子，特别是急性期蛋白血清淀粉样蛋白A (SAA)来重塑肿瘤微环境。接下来，我们建立了离体患者源性类器官(PDOs)和外周血单个核细胞(PBMCs)共培养模型，以评估SAA的免疫生物学影响。我们发现SAA不仅通过诱导肿瘤干细胞转化促进化疗耐药，还通过驱动2型免疫抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤纤维化，α-SAA中和抗体可以抑制治疗耐药和肿瘤纤维化。机械上，我们发现SAA诱导的恶性表型依赖于P2X7受体。我们的数据表明，分泌SAA的癌症干细胞通过P2X7受体驱动癌症干细胞转化和2型免疫极化，在促进治疗耐药和肿瘤纤维化方面具有显著的生物学影响。值得注意的是，α-SAA中和抗体通过限制这些恶性表型显示出治疗潜力。
很大一部分肺腺癌患者在刚确诊时就失去了手术的机会，只能依靠化疗、靶向治疗和新发展的免疫治疗等非手术治疗[1]。然而，耐药一直是困扰临床治疗多年的顽疾[2]。
肿瘤内异质性确实是肿瘤耐药的主要原因之一。肿瘤由不同类型的细胞组成，具有不同的遗传、表观遗传和表型背景/特性，这使得它们对不同的治疗反应不同[3,4]。肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)是肿瘤细胞的一个亚群，具有干细胞样特性，负责肿瘤的起始、维持和对治疗的抵抗[5,6,7]。
在我们之前的研究中，我们使用流式细胞术鉴定了原发性肺腺癌(LUAD)中高度原始的癌症干细胞亚群。这些细胞以CD133+/CD44+/CD24-为特征，并表现出化疗耐药[8]。在目前的研究中，我们进一步发现CD133+癌症干细胞群也具有高度炎症性，并分泌许多炎症因子。其中，我们发现肿瘤微环境中的血清淀粉样蛋白A (SAA)主要由肿瘤干细胞分泌。SAA是一种急性期蛋白，在炎症反应中产生，参与调节免疫反应、组织修复和肿瘤进展[9]。SAA已被证明通过调节肿瘤微环境促进肿瘤生长、血管生成和转移。在包括肺癌在内的各种类型的癌症中，血液或肿瘤组织中高水平的SAA与预后不良有关[10,11,12,13]。
Smole等报道SAA是驱动2型免疫的可溶性模式识别受体[14]，提示CSCs分泌SAA也可能参与抗癌免疫的调控。1型和2型免疫是两种主要的免疫反应类型，1型免疫的特征是T辅助1 (TH1)细胞的激活和干扰素γ (IFN-γ)等细胞因子的产生，这对消除细胞内病原体和肿瘤细胞很重要。另一方面，2型免疫的特征是T辅助2 (TH2)细胞的激活和白细胞介素-4 (IL-4)等细胞因子的产生，这对于消除细胞外寄生虫和过敏原非常重要[15,16,17]。在抗癌免疫方面，1型免疫通常被认为比2型免疫更有效，因为它可以激活细胞毒性T淋巴细胞(ctl)来识别和杀死肿瘤细胞[18,19,20]。2型免疫也与伤口愈合和纤维化密切相关。过度的2型免疫，特别是相关的组织纤维化，可导致免疫抑制的肿瘤微环境，促进肿瘤生长和转移[15,21]。因此，我们进一步探讨了SAA对1型和2型免疫平衡的影响。
在目前的研究中，我们发现SAA主要由癌症干细胞群分泌。为了研究SAA的生物免疫作用，我们将重组SAA和α-SAA中和抗体引入离体肿瘤类器官-外周血单个核细胞模型。我们观察到SAA促进癌症干细胞转化，而α-SAA显著限制癌症干细胞的扩增。此外，我们发现SAA信号通过驱动2型免疫抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤纤维化，α-SAA中和抗体可能具有治疗潜力。
细胞异质性的深度分析需要基于多重单细胞的技术，如scRNA-Seq、流式细胞术或免疫荧光染色(定量分析)。我们首先使用了一个健壮的scRNA数据集，该数据集包括来自公开可用的GSE131907数据集的11个肿瘤样本[22]。为了确保数据的高质量，我们进行了全面的质量控制分析，包括评估细胞计数深度、检测到的基因数量和线粒体基因数量(图S1-1A-F)[23]。最终，我们确定了9例原发性肺腺癌样本符合我们严格的质量控制标准。接下来，我们使用Seurat软件包使用t分布随机邻居嵌入(tSNE)算法对细胞进行聚类，然后我们确定了一个具有无序拷贝数变化的恶性群体(图1A, B)。尽管我们研究中分析的所有样本都来自LUAD组织，但我们观察到这些样本中细胞组成的变化(图S1G)。
图1:癌症干细胞具有高度炎症性，并分泌SAA。
A, B引入GSE131907进行恶性细胞单细胞mRNA和拷贝数变异分析(scRNA-Seq分析详见图S1)。C在不同细胞亚群中SAA的表达(SD平均值，单因素方差分析和事后分析)。CD133+或CD133-恶性人群中SAA的D表达(SD平均值，t检验)。E-G建立LUAD肿瘤类器官，流式细胞术检测CD133+和CD133-肿瘤细胞群细胞内SAA水平(均数SD, t检验)。选取10例肺癌FFPE标本进行免疫荧光成像，对SAA、CD133、Pan-CK、DAPI进行染色。统计不同亚群的百分比(标准差平均值，单因素方差分析和事后分析)。J入组肺癌患者的PFS KM图(Gehan-Breslow-Wilcoxon检验)。
接下来，我们对TCGA_LUAD数据集中的大量样本进行分析，选择CD133 (PROM1)表达前5和后5个样本进行GSEA分析。我们的研究结果显示CD133与EMT(上皮-间质转化)以及炎症反应之间存在显著相关性(图2)。这一发现表明CD133是一种可靠的干细胞生物标志物，癌症干细胞与炎症过程有关。我们还观察到CD133hi组急性期蛋白SAA1/2的高表达(图S1-2B)。之后，我们测量了scRNA数据中SAA在不同主要亚群之间的分布，我们发现SAA主要在恶性上皮细胞中表达，CD133+恶性细胞表达更多的SAA，这表明这个原始的癌症干细胞群体炎症性更强(图1C, D)。
为了评估SAA蛋白在不同LUAD亚群中的分布，我们使用了患者来源的类器官(图1E, F)，在肿瘤类器官中，我们首先确定了Pan-CK+/CD133+/CD44+/CD24-群体作为原始癌症干细胞群体，在细胞内染色中，我们观察到癌症干细胞群体中SAA信号水平显著提高(图1G)。此外，在临床样本中，我们观察到大多数CD133+肺癌恶性细胞表达高水平的SAA (n=10，图1H, I)。然而，由于样本量有限，我们无法建立SAA表达与患者生存之间的相关性(图1J)。综上所述，我们发现原始肿瘤干细胞群体具有炎症表型，表达较高水平的SAA。
在多种类型的肿瘤中均发现SAA水平升高，有证据表明SAA可促进肿瘤生长和转移[10,24]，我们进一步探讨了SAA在离体类器官模型中的生物学影响。
我们在类器官培养模型中引入SAA中和抗体(α-SAA, 500 μg/ml)和重组人SAA1蛋白(rec. SAA1, 50 μg/ml)，通过连续稀释实验测定α-SAA和rec. SAA诱导或抑制类器官干性转化的能力，确定其最佳影响浓度(图S2A)。我们发现，中和SAA限制了肿瘤干细胞群体的扩张(3/6)，而另一方面，在肿瘤微环境中引入rec. SAA则促进了肿瘤干细胞群体的扩张(3/6，图2A, B)。此外，我们发现SAA还促进细胞静止(图2C, D)，我们进一步在类器官离体培养模型中引入5μM cDDP(顺铂)，我们发现中和SAA能有效抑制化疗耐药(5/6)，而rec. SAA能促进化疗耐药(5/6)。图2 e)。
图2:SAA通过驱动干细胞转化和细胞静止来促进化学耐药。
在肿瘤类器官模型中引入A、B α-SAA中和抗体和rec. SAA1蛋白，用流式细胞术对6个类器官样本的CD133+/CD44+/CD24-肿瘤干细胞群体进行免疫表型分型(均数标准差，单因素方差分析，事后分析)。恶性细胞中Hoechst 33342和Pyronin γ双阴性群体被鉴定为G0(静止)群体(SD平均值，单因素方差分析和事后分析)。在类器官模型中加入E 5 μM cDDP，收集上清进行LDH测定(细胞毒性测定)(SD平均值，单因素方差分析和事后分析)。F、G流式细胞术对CSCs细胞进行分选，并标记CellTracker，将标记后的CSCs细胞与其他癌细胞混合，7天后流式细胞术对细胞进行免疫分型，测定CSCs群体中CellTracker的强度(标准差平均值，单因素方差分析，事后分析)。选取10例肺癌FFPE标本进行免疫荧光成像，对SAA、CD133、Pan-CK、Ki-67和DAPI进行染色。统计不同亚群的百分比(标准差平均值，单因素方差分析和事后分析)。
接下来，为了研究SAA是通过促进肿瘤干细胞群体的自我更新还是通过诱导其他肿瘤细胞的去分化来促进干细胞转化，我们对CD133+肿瘤干细胞群体进行了分类，并使用CellTracker对其进行了标记，随后将标记的肿瘤干细胞再次与其他肿瘤细胞混合，在含有重组SAA1或α-SAA的类器官培养基中培养5天。我们发现，SAA信号同时促进CSCs自我更新和非CSCs去分化，但SAA信号主要通过促进CSC群体的自我更新来促进干细胞转化(图2F, G)。为了临床验证，我们招募了10个肺癌FFPE样本，对SAA、CD133和Ki67进行多重成像。我们的研究结果表明，CD133的表达不仅与SAA表达相关，而且与Ki67水平呈负相关，表明CD133+细胞处于静止状态(图2H, I)。最后，在细胞系表型分析中也观察到类似的结果，我们发现SAA中和限制了菌落的形成和伤口愈合能力(图S2E-H)，但对细胞增殖的影响较小(图S2B, C)。
在这里，我们报道了SAA促进LUAD的干细胞转化(主要是通过促进CSC自我更新)和细胞静止，从而促进耐药性。此外，我们观察到针对SAA的中和抗体可以抑制这些恶性表型。
为了探讨SAA信号在抗肿瘤免疫中的生物学影响，我们建立了自体离体类器官-PBMCs共培养模型，如图3A所示。采集LUAD患者新鲜肿瘤和外周血进行肿瘤类器官培养和PBMCs分离，分离后的PBMCs先冷冻保存。肿瘤类器官建立成功后，首先将pbmc暴露于肿瘤抗原(α-PD-1、0.2 mg/ml、替利珠单抗、百济神州)下进行T细胞群的激活和扩增，然后将pbmc与制备好的肿瘤类器官在96孔u型板中共培养。72h后收集共培养的上清和细胞，测定上清LDH水平以评估免疫细胞毒效率，并用流式细胞术对细胞进行多种T细胞标记物染色，进行多重免疫分型(图S2B)。
图3:SAA抑制α-PD-1诱导的抗肿瘤细胞毒性免疫反应。
自体离体肿瘤类器官- pbmcs共培养模型的流程分析。在共培养模型中引入B α-PD-1 (Tislelizumab)，收集上清液测定LDH(标准差平均值，单因素方差分析和事后分析)。C、D共培养模型中加入α-SAA中和抗体和rec. SAA1蛋白，收集上清进行LDH测定(免疫细胞毒性测定)(标准差平均值，单因素方差分析，事后分析)。共培养模型中加入E α-SAA中和抗体和rec. SAA1蛋白，3 d后收集细胞流式细胞术进行免疫分型。F、G测量CD45+/CD3+/CD8+ CTLs和CD45+/CD3+/CD8+/GrB+ CTLs的百分比(标准差平均值，单因素方差分析，事后分析)。选取10例肺癌FFPE标本进行免疫荧光成像，对SAA、CD8、Pan-CK、DAPI进行染色。I评估CD8+细胞百分比与SAA+细胞百分比的相关性(线性回归)。
在离体共培养实验之前，我们使用TCGA-LUAD数据集进行了生物信息学分析。我们将前5个和后5个SAA表达样本提交GSEA分析。我们发现SAA表达与炎症反应之间存在显著相关性(图S3B, C)。值得注意的是，我们还观察到SAA表达与EMT以及CD133之间存在正相关(图S3A, B)。
肿瘤免疫耐受是许多类型癌症中普遍存在的现象[25]。临床上，α-PD-1可阻断PD-1受体与其配体PD-L1的相互作用，使免疫平衡向抗肿瘤免疫方向转变。正如我们所料，在自体类器官- pbmcs共培养模型中也观察到肿瘤免疫耐受。通过测量上清液中的LDH水平，我们发现pbmc和类器官组的细胞死亡水平与不含α-PD-1的共培养组相似(图3B)。此外，我们观察到400 μg/ml α-PD-1 (Tislelizumab)足以在共培养模型中诱导显著的免疫相关细胞死亡(图3B)。
接下来，我们将α-SAA和rec. SAA引入到自体类器官- pbmcs共培养模型中，使用连续稀释(400 μg/ml Tislelizumab)。我们发现，在共培养模型中，rec. SAA显著抑制了杀伤效果，而α-SAA促进了杀伤效果(图3C, D，通过上清中LDH释放量测量)。此外，我们观察到SAA信号(40 μg/ml, rec. SAA1)显著阻碍CD45+/CD3+/CD8+细胞毒性T淋巴细胞(ctl)和颗粒酶B+ (GrB) ctl的扩增。然而，SAA中和抗体(300 μg/ml)的使用增强了抗肿瘤免疫，并导致ctl和GrB+ ctl群体的扩增(图3E-G)。最后，在10个临床肺癌样本中，我们观察到SAA+细胞的百分比与肿瘤浸润性CD8+细胞毒性T淋巴细胞呈显著负相关(图3H, 1)。
综上所述，我们报道了SAA对抗肿瘤免疫具有强大的生物学影响，α-SAA中和抗体显著促进α-PD-1介导的抗肿瘤免疫诱导的杀伤作用。
Smole等人报道SAA是驱动2型免疫的可溶性模式识别受体[14]。然而，抗肿瘤免疫主要是由th1介导的1型免疫反应诱导的[26]。因此，我们进一步探讨SAA信号是否通过促进2型免疫的极化来抑制抗肿瘤免疫。
在类器官- pbmcs共培养模型中，我们使用多重流式细胞术研究了SAA对细胞因子释放和T辅助细胞(THs)极化的影响。我们确定CD45+/CD3+/CD4+/IFN-γ+ THs为TH1细胞，CD45+/CD3+/CD4+/IL-4+ THs为TH2细胞(图S2B)， TH1或TH2细胞的分布反映了1型和2型免疫之间的平衡。
我们发现SAA信号显著影响多种TH1 / TH2极化和抗肿瘤免疫相关细胞因子的释放，包括IFN-α、IL-1β、IFN-γ、IL-4等(图4A)。此外，我们发现rec. SAA促进TH2细胞群的扩增，降低TH1细胞群的扩增，而α-SAA对2型免疫极化的影响相反(图4B-D)，阻断IL-4信号不影响TH2细胞的扩增(图S4F)。TH1和TH2细胞的扩张通常是互斥的，这意味着当一个群体扩张时，另一个群体受到抑制。我们还发现TH1和TH2细胞的扩增呈显著负相关(图4E)，表明SAA信号具有调节T辅助细胞极化的能力，影响1型和2型免疫的平衡。
图4:SAA通过驱动T细胞抑制抗肿瘤免疫H2极化。
将α-SAA中和抗体和rec. SAA1蛋白引入离体肿瘤类器官- pbmcs共培养模型(来自5例独立患者，分离数据见图S4A-E)， 3天后收集细胞，采用细胞计数珠阵列检测细胞因子。在离体肿瘤类器官- pbmcs共培养模型中引入B α-SAA中和抗体和rec. SAA1蛋白，3 d后收集细胞流式细胞术进行免疫分型，检测CD45+/CD3+/CD4+/IFN-γ+ TH1细胞和CD45+/CD3+/CD4+/IL-2+ TH2细胞。C、D检测TH1和TH2细胞的百分比(标准差平均值，单因素方差分析，事后分析)。E . TH1和TH2细胞百分比的相关关系。F，在96孔平板上进行额外的共培养实验(其余在u型板上)。G, 3 d后，在明场显微镜下计数T细胞克隆形成单位(CFU)(平均标准差，单因素方差分析，事后分析)。
此外，我们观察到，在SAA中，向2型免疫的极化对抗肿瘤免疫有显著的负面影响，这可以通过T细胞形成的集落形成单位(cfu)数量的减少来证明。相反，α-SAA处理导致形成的T细胞cfu数量显著增加(图4F, G)。
综上所述，我们发现SAA促进TH2细胞的扩增，抑制TH1细胞的扩增，导致抗肿瘤免疫能力下降。
2型免疫在癌症的发生和发展中发挥作用，2型细胞因子(如IL-4和IL-13)可以抑制细胞毒性T细胞的功能，从而限制T细胞消灭癌细胞的能力[15]。然而，2型免疫与癌症之间的关系是复杂的，具有环境依赖性，在本研究中，我们从分泌组的角度进一步评估了SAA诱导2型免疫的机制。
卵清蛋白(OVA)是一种常用的抗原来诱导2型免疫反应。在共培养模型中，我们发现OVA显著诱导IL-33、IL-25、TSLP等多种诱导/促进型细胞因子的分泌，而α-SAA进一步促进了诱导/促进型细胞因子的分泌，而α-SAA则限制了这些细胞因子的释放(图5A、图S5A和图D)，提示SAA调节了参与2型免疫的细胞因子的分泌。
图5:SAA驱动恶性细胞分泌2型免疫促进因子。
在类器官-PBMCs共培养、PBMCs或类器官培养模型中，加入卵清蛋白(Ovalbumin)诱导2型免疫。A 3 d后，在共培养模型中测定上清液IL-33浓度(标准差平均值，单因素方差分析和事后分析)。B 3天后，在PBMCs培养模型中测量上清IL-33浓度(SD平均值，单因素方差分析和事后分析)。C 3天后，在类器官培养模型中测量上清IL-33浓度(SD平均值，单因素方差分析和事后分析)。D、E共培养模型中加入α-IL-33中和抗体和rec. SAA1蛋白，3 D后收集细胞流式细胞术进行免疫分型(均数标准差，单因素方差分析，事后分析)。
接下来，为了研究哪种细胞类型对SAA信号的2型细胞因子分泌变化最显著，我们分别使用恶性细胞(类器官)或免疫细胞(PBMCs)进行了实验。有趣的是，当SAA信号被刺激或阻断时，类器官在释放2型细胞因子，尤其是IL-33方面表现出最显著的变化，而不是pbmc(图5B、C、S5B、C、E和F)，这表明SAA和α-SAA主要是调节类器官，而不是直接影响免疫细胞。进一步探索，在共培养实验中引入α-IL-33中和抗体。我们发现α-IL-33抗体能够抑制rec. SAA诱导的TH2极化(图5D, E)，促进ctl的扩增(图S5G, H)。
综上所述，这表明SAA促进2型免疫的作用至少部分是通过诱导恶性细胞分泌IL-33介导的。
2型免疫和细胞因子参与促进组织纤维化，细胞因子如IL-4、IL-13和TGF-β主要由2型免疫细胞如TH2细胞产生，已被证明在促进纤维化中起关键作用[15]。我们进一步研究了SAA信号与肿瘤纤维化的关系。根据其粘附能力从原代LUAD样品中收集纤维细胞/成纤维细胞，同时收集悬浮细胞进行类器官培养。
收集原代LUAD样本的纤维细胞/成纤维细胞并冷冻保存。一旦肿瘤类器官建立(通常在15-25天后)，与纤维细胞、pbmc(如图3A所示制备)和类器官建立共培养体系，以研究SAA对肿瘤纤维化的影响(图6A)。
图6:SAA诱导的分泌组促进纤维化。
类器官- pbmc -纤维细胞共培养流程图。B、C共培养模型中加入α-IL-33中和抗体和rec. SAA1蛋白，3 d后收集细胞流式细胞术进行纤维细胞免疫表型分析(α-SMA+细胞鉴定为纤维细胞)(平均标准差，单因素方差分析，事后分析)。
在纤维细胞- pbmcs -类器官共培养体系中，引入SAA和α-IL-33中和抗体，收集共培养细胞进行免疫分型，流式细胞术鉴定α-SMA+细胞为纤维细胞。结果显示，rec. SAA显著促进了纤维细胞的扩张，而α-IL-33阻断2型细胞因子显著抑制了SAA诱导的纤维细胞的扩张(图6B, C)， α-SAA抑制了OVA诱导的肿瘤纤维化(图S6A)。综上所述，我们发现SAA诱导2型免疫/细胞因子促进肺腺癌的肿瘤纤维化。
我们进一步探讨了SAA促进癌症干细胞转化和2型细胞因子释放的表型机制。据报道，SAA可以在不同的细胞类型/生物条件下作为多种受体的配体，包括TLR2/4 (toll样受体2/4)[27,28]，P2X7 (P2X嘌呤受体7)[29]和FPR2(配对甲酰基肽受体2)[30]。但尚不清楚在肺癌的竞争中哪个受体主导SAA诱导的干细胞转化和2型免疫，因此我们引入了sirna敲低P2X7和FPR2(敲低效率数据见图S6B)和TIRAP抑制剂(TIRAP是一种与toll样受体相关的适配器分子)[31]。
我们的研究结果表明，H1650和A549细胞系中FPR2的敲低并不影响SAA诱导的CD133强度升高或IL-33的释放(图7A-D)。同样，TIRAP抑制剂不影响saa诱导的CD133表达或IL-33释放(图7E-H)。然而，有趣的是，P2X7的敲低显著抑制了SAA诱导的癌干转化和IL-33的释放(图7A-D)，提示SAA与P2X7之间存在联系。
图7:SAA-P2X7相互作用促进肿瘤干细胞转化和2型细胞因子释放。
P2X7或FPR2敲低和野生型H1650和A549细胞系分别用或不加rec. SAA1处理。A-C流式细胞术检测细胞表面CD133的强度(SD平均值，单因素方差分析和事后分析)。D上清液IL-33采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定(标准差平均值，单因素方差分析，事后分析)。野生型H1650和A549细胞系分别用或不加TIRAPi (TIRAP抑制剂)处理，流式细胞术检测E-G CD133 (SD平均值，单因素方差分析，事后分析)。H采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定上清白细胞介素-33(均数采用标准差，单因素方差分析采用事后分析)。
综上所述，我们的研究结果表明，在肺癌中，SAA诱导的2型免疫的癌干性转化和释放依赖于P2X7。
摘要。
介绍
结果
讨论
材料与方法
数据和材料的可用性
数据可用性
材料的可用性
参考文献。
致谢。
作者信息
道德声明
补充信息
# # # # #
据报道，癌症干细胞是癌细胞的一个亚群，能够自我更新、肿瘤启动和治疗抵抗[5]。在我们之前的研究中，我们报道了肿瘤干细胞群因其静止行为而对化疗具有高度耐药性[8]。在本研究中，我们使用scRNA-Seq技术来探索实体肿瘤的肿瘤内异质性。单细胞测序(scRNA)技术能够以最小的样品输入量进行无偏高通量分析，并提供了一种研究单个细胞功能状态的方法[32,33]。
据报道，癌症干细胞群体与炎症之间的关系是复杂和多方面的，两者可能以双向的方式相互影响[34,35]。我们的研究结果表明，除了具有自我更新、肿瘤启动和治疗抵抗特性外，CSCs还具有高度炎症性，并在肿瘤微环境中分泌许多炎症因子。接下来，我们发现在肿瘤微环境中，急性期蛋白SAA是由CD133+癌干细胞群体初步分泌的。
SAA是一个小的急性期蛋白家族，主要在炎症和组织损伤时产生[9]。在各种类型的癌症中都观察到SAA水平升高[10,24,36]。然而，癌细胞产生大量SAA的原因尚不清楚。我们首先研究了SAA对癌症干细胞转化的影响。在肿瘤类器官中，我们发现SAA促进肿瘤干细胞群的扩增。此外，我们发现重组SAA通过诱导肿瘤干细胞转化显著增加耐药。重要的是，我们还发现用抗体中和SAA可以提高化疗敏感性(图2)。这表明α-SAA中和抗体可能在化疗中具有治疗潜力。研究表明，SAA可能通过促进和转移在癌症的发生和发展中发挥作用。SAA还可以调节免疫反应，可能导致肿瘤逃避和抵抗治疗[37,38]。
由于SAA是一种分泌急性期蛋白，我们也研究了它对抗肿瘤免疫的影响。为了更好地了解人体宿主抗肿瘤微环境，我们设计并实现了自体离体类器官- pbmc共培养模型。该模型允许我们测量T细胞对自体恶性类器官的免疫细胞毒性作用，并探索T细胞的分化特征。我们的研究结果表明，SAA信号限制了1型免疫的极化，同时促进了2型免疫的极化，这是通过调节恶性细胞分泌2型细胞因子如IL-33来实现的。最终，这限制了T细胞对恶性细胞的细胞毒杀伤作用，这是由PD-1抗体在我们的离体共培养模型中介导的(图3、4和5)。
有趣的是，Smole等人也报道SAA作为一种可溶性模式识别受体，驱动2型免疫[14]。他们发现SAA以saa1依赖的方式驱动肺上皮释放2型促进细胞因子，如IL-33。这些结果与我们的研究结果一致，表明恶性肺癌细胞可能利用这种生理致敏机制来促进2型免疫的极化，限制抗肿瘤杀伤。
2型细胞因子，如IL-4、IL-5和IL-13，也参与成纤维细胞的活化和分化[15]。此外，2型细胞因子还可以刺激参与纤维化过程的其他细胞的募集和活化[39,40]。例如，IL-4和IL-13可以诱导巨噬细胞向交替活化表型极化，这与组织修复和纤维化有关[41]。肿瘤纤维化通常是由2型细胞因子主导的慢性炎症引发的，2型细胞因子常存在于肿瘤微环境中[42]，在几种类型的癌症中，肿瘤纤维化与预后不良和恶性程度增加有关[43,44]。我们发现SAA诱导的2型免疫显著促进了纤维细胞的扩张，表明其参与了肿瘤纤维化。此外，α-SAA中和抗体的使用可显著减少OVA诱导的肿瘤纤维化。对于机制探索，虽然SAA已被报道有许多受体，但我们发现在肺癌的背景下，SAA诱导的肺癌细胞干性转化依赖于P2X7。
因此，我们的研究发现肺癌干细胞群体分泌的急性期蛋白SAA通过驱动2型免疫，依赖于SAA- p2x7的相互作用，促进肿瘤干细胞转化、肿瘤纤维化和抑制抗肿瘤免疫，我们还特别强调了α-SAA中和抗体的治疗潜力。
H1650细胞和A549细胞来自美国型培养收集(ATCC, USA)，未见支原体污染。细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素(Thermo Fisher)的RPMI1640培养基(Thermo Fisher)中培养，在含5% CO2的加湿培养箱中37°C培养，细胞系转染Lipofectamine 3000按照官方说明使用siRNA, P2X7: 5' -CUUUAACGUCGGCUUGGGCUC-3 '和5' -GCCCAAGCCGACGUUAAAGUA-3 '， FPR2: 5'- ggagauguguauaguacautt -3'和5'-AUGUACAAUACACAUCUCCTT-3'。
在肺腺癌(LUAD)患者手术切除后，收集新鲜的肿瘤切除并立即冰冻。样品保存在含有一级样品储存缓冲液(编号PDO-0012，南京牧神生物科技有限公司)的无菌管中，并冰冻运输至实验室。样品在24 h内运至实验室，以确保最佳质量。肿瘤组织到达后，用一级样品洗涤缓冲液(#PDO-0013，南京福恩生物科技有限公司)在室温下在轨道振动器上洗涤30分钟。之后，将肿瘤组织切成小块(大约芝麻大小)，用酶消化缓冲液(编号PDO-0016，南京牧神生物科技有限公司)在37°C的热激器中消化30-50分钟。对细胞悬浮液进行强力移液以确保完全解离，并通过70 μm细胞滤池。然后将细胞悬液用Matrixgel (40183ES10, Ceturegel?Yeasen Biotechnology)重悬，并接种于6孔板。前48 h，原代细胞在含有ROCKi(10μM, ROCK抑制剂，仅前24 h)的肺癌类器官培养基(# p多- l006，南京羊怪生物科技有限公司)中培养[44,46]，每48 h更换一次不含ROCK抑制剂的新鲜培养基。
当类器官汇合或直径超过300 μm时，应分开。建立的类器官可按1:2-1:4的比例每15-25天传代一次。开始传代过程时，先去除完整的类器官培养基，然后将organoid- matrixgel滴液重悬于类器官传代缓冲液中(# pso -0016，南京丰生物科技有限公司，每孔1 mL)， 37℃孵育5 - 15分钟，之后每5分钟用移液器重悬一次。为了抑制消化，应将混合物用冷PBS稀释10倍。然后将混合物在300 g下在4°C下旋转5分钟，并去除上清。此步骤应重复至少2次，以完全去除凝胶。
对于肿瘤反应性T细胞制备，在含有edta的管中收集5ml全血。在50ml管中用PBS 1:1稀释血液。将稀释后的血液在15ml Ficoll-Paque Plus (Cytiva)上分层置于锥形管中。室温下400g离心30分钟，不刹车。收集含有pbmc的界面层并将其转移到新的50ml锥形管中。通过向试管中加入PBS洗涤pbmc，直到它几乎满。室温下300g离心10分钟。丢弃上清，将细胞颗粒重新悬浮在PBS或适当的缓冲液中，以供下游应用。对于肿瘤反应性T细胞的制备，采用板键功能级CD3 / CD28抗体(#TC0011，南京羊峰生物科技有限公司)培养PBMCs，并补充IL2 (#TC0035，南京羊峰生物科技有限公司)、PD-1抗体(Tislelizumab, BeiGene)和肿瘤抗原(经50 Gy电离辐射处理的类器官)3天。PDOs-PBMCs共培养时，收集并计数上述肿瘤类器官和肿瘤反应性T细胞，并将免疫细胞-类器官细胞按5:1 ~ 8:1的比例在u底96孔板(部分为平底96孔板)共培养，3天后收集共培养细胞和上清进行进一步分析。共培养模型中引入的抗体或蛋白包括SAA抗体(# 924903,R&D)， IL-33抗体(# 40015D, R&D)， rec人SAA1 (300-53, PeproTech)和IL-4R中和抗体(10402-R401, sinobobological)。
细胞系表型检测采用cell Counting Kit-8 (C0038, Beyotime)测定细胞增殖率，将2000个细胞/孔接种于96孔板中，用板读仪测定吸光度。创面愈合实验:将细胞接种于六孔板，24 h后在细胞融合单层上形成人工划痕创面，然后加入无血清培养基，于基线和24 h对细胞成像。为了进行集落形成实验，将200个细胞置于新鲜的6孔板中，并在含有10% FBS的培养基中维持，10天后，用4%多聚甲醛固定细胞，并用0.1%结晶紫染色。可见菌落是手工计数的。
FACS染色时，将细胞洗涤后，以106个细胞/ml的浓度在PBS中重悬，室温下15分钟进行固定活力染料(Fixable Viability Dye, FVD)染色(Thermo fisher, 65-0866- 14,65 -0867- 14,65 -0863-14或L34957)。然后用阻断缓冲液(#FH0008，南京牧神生物科技有限公司)预孵育15分钟，然后用FACS抗体(表S1)在4度下表面染色20分钟，然后将细胞固定并渗透(IntraStain kit, F0063，南京牧神生物科技有限公司)。然后在室温下细胞内染色20分钟(抗体见表S1)。细胞周期分布测定:收集细胞并固定，PBS洗涤两次，然后进行Hoechst 33342 (Sigma)、Pyronin y (Sigma)和Pan-CK染色。流式细胞术分析和细胞分选在FACSAria II流式细胞仪或FACSCelesta细胞仪(BD Biosciences)上进行。使用FlowJo (version 10.4;FlowJo LLC)。每项测定均为三份。
上清细胞因子检测采用以下ELISA试剂盒:IL-33、900-M398、PeproTech;il - 25,900 - m234, PeproTech;TSLP, 88-7497-22, Thermo Fisher。数据收集在一个96孔板阅读器测量光密度(od)在450 nm。上清LDH测量使用Beyotime公司的C0016。为标记细胞，引入Thermo Fisher, CellTracker, C10094和C2927的试剂。图4A和图S4A-E中其他炎性细胞因子的测量，在我院检验科采用BD临床IVD水平细胞计数珠阵列。
为了研究SAA和PROM1 (CD133)的生物学特性，我们分析了scRNA-Seq肿瘤数据(GSE131907)[22]。我们评估了每个样本的RNA特征数量、绝对UMI数量和线粒体基因分布，并建立了选择nFeature≥2000、2000≤nCount≤5000和百分比的样本的标准。太≥5%。为了进一步减少混杂因素，我们纳入了红细胞的比例，因为它们缺乏细胞核和转录组。利用这一特征，我们计算了红细胞的比例。
然后，我们应用t分布随机邻域嵌入(t-SNE)算法来可视化细胞关系，并计算每个簇的基因。使用“SingleR”R包[47]，我们识别了数据集中的细胞类型。上皮细胞群体被定义，并使用“intercnv”R包进行拷贝数变异分析[48,49]。最后，我们可视化了SAA和PROM1在不同样品中的表达差异。
在免疫荧光成像方面，回顾性选取肺癌患者的FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)标本共10例，使用标本的石蜡切片(5μm)进行免疫荧光染色。石蜡切片在60℃下加热1 h，然后在二甲苯中再水合2次，5 min，用揭膜液进行抗原回收，然后阻断，用直接免疫荧光一抗孵育(过夜，4℃)，SAA-APC;CD133-AF488;Pan-CK-AF594;Ki67-BV605和CD8-AF488(详见表S1)用DAPI (C1005, Beyotime)染色并挂载。
图像由Dragonfly 500共聚焦显微镜系统(Andor, Oxford Instruments)拍摄。为了定量，在不同的实验中对5个不同的视场进行成像，并通过Imaris 9.9.0软件(Oxford Instruments)计算指示的平均荧光强度。所有图像均在相同的曝光时间、倍率和荧光强度下获得。
使用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，使用BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime, China)测定蛋白浓度。然后将蛋白质在10% SDS-PAGE凝胶上电泳，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。阻断后，将膜与一抗(详见抗体表)在4℃下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在室温下孵育1.5小时。最后，使用增强化学发光(ECL)试剂盒(Beyotime, China)检测斑点。
按照官方指示进行基因集富集分析(GSEA)。数据以平均值±SD(标准差)表示，并使用学生t检验进行分析。以P < 0.05为差异有统计学意义(*P < 0.05， **P < 0.005， ***P < 0.0005)。使用Excel (Office 365, Microsoft)和GraphPad Prism (version 9.5.1, GraphPad Software, Inc)软件进行统计分析和图表制作。
本文使用的所有数据集均以基因表达综合检索号(Gene expression Omnibus access Number)进行引用。本研究过程中产生和分析的所有数据都包含在这篇发表的文章及其补充信息文件中。如有合理要求，可向通讯作者索取更多数据。
ccDownload: /内容/ pdf / 10.1038 / s41419 - 023 - 06198 - w.pdf
