Autotaxin (ATX)是一种将溶血磷脂酰胆碱转化为溶血磷脂酸(LPA)的分泌酶。LPA刺激细胞增殖和迁移，促进组织损伤后的伤口修复。ATX水平与几种人类癌症的分期和分级直接相关。近年来开发了几种小分子ATX抑制剂。IOA-289是一种有效的ATX抑制剂，用于治疗含纤维化的癌症。本研究通过IOA-289对不同胃肠道肿瘤细胞系的作用，评价其对肿瘤细胞活力和运动能力的影响。
为了确定增加IOA-289浓度对细胞活力和增殖的影响，我们使用了结晶紫测定法，一种在基质中进行的克隆测定法，并在体外模型中评估了抑制剂对3D球体形成的影响。用氧化还原染料分析了IOA-289对细胞周期相的影响。采用伤口愈合试验和transwell迁移试验评估细胞迁移能力。为了评估抑制剂的促凋亡作用，细胞采用Annexin V染色，免疫荧光和流式细胞术分析。抗体阵列也被用来区分，在不同的样品中，43蛋白参与凋亡途径的差异表达。
我们发现IOA-289能够抑制胃肠道肿瘤细胞系的生长和迁移，无论是在2D(结晶紫实验)和3D体外模型(在基质中形成球体和克隆实验)中。这种效果是剂量依赖性的，药物在不含fbs的培养基中施用时最有效。对细胞生长的抑制作用是由于IOA-289的促凋亡作用。fitc偶联的Annexin V染色显示，IOA-289在孵育24 h后，荧光呈剂量依赖性增加，Annexin/PI染色的流式细胞术也能区分出凋亡细胞。抗体阵列显示，用IOA-289处理可导致所有测试细胞系中几种促凋亡蛋白的表达增加。
这些结果表明IOA-289可能是一种治疗胃肠道肿瘤的有效药物，特别是那些以高度纤维化为特征的肿瘤。
溶血磷脂酸(LPA)是一种具有生物活性的磷脂，可以作为信号分子，调节各种细胞类型的许多细胞效应。LPA可以通过细胞内途径合成，以磷脂或二酰基甘油为前体，也可以通过细胞外途径合成，由溶血磷脂酰胆碱生成，通常存在于质膜的细胞外小叶或与其他蛋白质结合，如白蛋白[1]。溶血磷脂酰胆碱通过Autotaxin (ATX)转化为LPA, ATX是一种分泌的糖蛋白，具有溶血磷脂酶D活性，由外核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶2 (ENPP2)基因编码[2]。
ATX有五种亚型分布在不同的组织中[3]。该酶由两个n端somatomedin B (SMB)样结构域，一个含有活性催化位点的中央磷酸二酯酶(PDE)结构域和一个c端核酸酶(NUC)样结构域组成。n端smb样结构域富含半胱氨酸，参与ATX与细胞表面β3整合素的相互作用[4]。PDE结构域还包含一个疏水脂质结合袋，可以结合不同的LPC和LPA物种[5,6]。ATX与整合素的结合使ATX的活性定位在细胞表面，允许LPA在其表面受体附近产生和传递[7,8]。LPA与六种不同的G蛋白偶联受体(LPAR 1-6)相互作用，激活多种通路和下游信号分子，如Rho、Ras PLC、PI3K[9]，调节细胞存活、增殖和运动等生理过程。
众所周知，ATX及其产物LPA在生理和病理条件下起着重要作用。在健康个体中，ATX通常在各种组织中表达，也可以在生物体液中发现[10]，但在几种肿瘤类型中发现表达增加。在肝细胞癌(HCC)患者中，与丙型肝炎和健康患者相比，ATX过表达[11,12]，在特发性肺纤维化和肺癌患者的肺组织中观察到ATX和LPA水平升高[13]。ATX基因在肾癌患者的肾肿瘤组织样本中被强烈上调[14]。
鉴于ATX/LPA轴在促进癌症发生中的突出作用，它可能是治疗癌症和炎症相关疾病(如慢性肝炎和肺纤维化)的有希望的靶点。
在过去的几年中，已经开发了几种小分子作为ATX抑制剂。这些分子可以通过与LPC竞争疏水口袋和结合酶的活性位点来发挥作用[15]。IOA-289是经iontura临床开发的口服ATX抑制剂，用于治疗高度纤维化实体瘤[16]。IOA-289不与ATX的催化锌区结合，但与底物口袋和LPA载流子通道结合，阻断ATX的两种功能。IOA-289抑制血浆LPA18:2的IC50为36 nM，对其他LPA物种也有类似的抑制效果。体外研究表明，IOA-289不仅可以调节肿瘤生长，还可以调节免疫抑制的纤维化微环境[16]。IOA-289通过活化成纤维细胞抑制IL-6和PAI-1的分泌，并且通过BioMAP表型筛选显示IOA-289可以抑制纤维化因子(sIL-6、MCP-1、αSMA、collagen-III)的表达[16]。此外，体外研究发现，IOA-289可以抑制癌症相关成纤维细胞释放的可溶性因子刺激癌细胞生长和影响T细胞向肿瘤部位募集的能力[17,18]。
本研究旨在评价ATX抑制剂IOA-289在实验性临床前模型中对不同胃肠道恶性肿瘤(包括肝内胆管癌(iCCA)、HCC、结直肠腺癌(CRC)和胰腺癌(PC))肿瘤进展的有效性。
人结直肠癌HT-29和Caco-2细胞、肝细胞癌HLE细胞、胆管癌RBE和KKU-M213细胞以及胰腺癌PANC-1和MIA PaCa-2细胞购自美国组织培养库(ATCC, Manassas, VA, USA)。肝癌细胞株HLF购自日本JCRB细胞库。所有细胞系在Dulbecco 's Modified Eagle培养基(DMEM)中培养，培养基中添加10%胎牛血清(FBS)、1 mM丙酮酸、25 mM HEPES、100 U/mL青霉素-链霉素(均来自Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)，并在37°C含5% CO2的潮湿环境中保持。介质每三天更换一次。ATX抑制剂IOA-289是iOnctura赠送的礼物。
细胞接种于96孔板，密度为2000个/孔，培养基中添加10%胎牛血清。24 h后，取出培养基，用PBS洗涤细胞，在有或没有FBS和不同浓度的IOA-289的情况下培养。在实验设定的时间(24,48和72 h)后，用4% PFA溶液固定细胞，并用0.02%结晶紫染色10分钟。随后用水冲洗板以去除多余的染料。细胞结合染料在1% SDS中再溶解，用iMark?微孔板吸光度仪(Bio-rad)在λ=570下测量光密度。
球体是用悬挂滴法创建的。在所有实验中，细胞以50,000个细胞/ml的浓度悬浮在含有0.24%甲基纤维素(Sigma)和补充2% FBS的培养基中，不存在或增加浓度的IOA-289。将25微升滴液移到100毫米培养皿的盖子上，将培养皿倒置在含有5毫升细胞培养基的培养皿上，以避免干燥。在37°C和10% CO2条件下孵育3天后，通过移液将球体转移到低附着6孔培养板(康宁)上。每个实验用NIKON Eclipse Ti2显微镜获得10-20个球体的图像，并用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)测量球体的大小。
96孔板的培养表面涂上一层薄薄的Matrigel (Corning)(30μl/孔)，在37℃下孵育20分钟，使其凝胶化。细胞胰蛋白酶化，并通过40μm网过滤，制成单细胞悬浮液。将含有2000个细胞的2微升培养基与28μl基质混合，并在先前包被的孔上分层。37℃凝胶化20 min后，加入90μl 10% FBS全培养基。24 h后，去除10% FBS培养基，用含有3、9和12μM IOA-289的2% FBS培养基代替。每2-3天更换一次培养基。培养10-14天后产生菌落，使用NIKON Eclipse Ti2显微镜在不染色的情况下显微镜下计数细胞团(至少有50个细胞)。
使用Cell- clock Assay Kit (bioccolor Life Science Assays, County Antrim, UK)对3、9和12μM IOA-289处理24小时的细胞系进行细胞周期分析。简单地说，将2.0 × 105个细胞/孔接种于24孔板上，在370C, 5% co2，至> 80%的融合度下孵育。然后用含有IOA-289的新鲜培养基处理细胞。24 h后，根据制造商的说明使用试剂盒观察细胞周期期。通过ImageJ软件分析图像，确定每个细胞周期的细胞比例。
细胞在10% FBS培养基中接种于12孔板中，培养至80-90%的合度。然后，用p200吸管尖在细胞单层上划痕。用无菌PBS洗涤板以去除碎片，并用记号笔在板的外底部做标记，作为参考点。每个细胞系在不含FBS的培养基中孵育，培养基中添加IOA-289的浓度(1-3-9-12μM)。使用共聚焦显微镜Nikon Eclipse Ti2在明场显微镜下获取0、24和48 h的图像，并使用Image-J软件测量划痕面积。采用以下公式评估细胞对创面愈合的迁移能力:[(0 h创面面积)-(指定时间创面面积)]/ (0 h创面面积)。
具有8μM孔(康宁公司)的细胞培养插入物包被50μl 10 mg/ml的1型胶原蛋白溶液(Gibco, USA)。1.5 × 104细胞在无血清培养液中，在不含或有12μM IOA-289的情况下，在上腔中镀上，底孔中充满完整的培养基。让细胞在膜上迁移至少16小时。孵育后，用4% PFA固定细胞10 '，并用0.02%结晶紫染色10 '。用自来水冲洗掉多余的染料，用棉签从膜的上表面刮掉未迁移的细胞。通过在10倍放大镜下计数至少5个视野中的平均细胞数来评估细胞迁移能力。
采用Annexin V-FITC试剂盒(Miltenyi Biotech, Germany)检测细胞早期凋亡。细胞在Nunc Lab-Tek II型载玻片上播种生长。PBS洗涤后，用IOA-289 3、9和12μM在无血清培养基中孵育细胞。2 h后，用Binding Buffer (BB)洗涤细胞，并用Annexin V-FITC抗体溶液在BB中染色15 '。用BB洗涤两次后，用4%多聚甲醛溶液固定细胞，用DAPI Ready Made solution with Antifade (Merck, US)将盖片固定在载玻片上。使用尼康Eclipse Ti2共聚焦显微镜采集图像，并使用ImageJ软件进行分析。
根据制造商的说明，使用Annexin V-FITC试剂盒，用3、9和12μM IOA-289处理24小时后，流式细胞术分析细胞凋亡。简单地说，使用StemPro Accutase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)分离贴壁细胞，并与任何漂浮细胞混合;106个细胞用1ml Binding Buffer (BB)洗涤。用100μl BB重悬球，加入10μl Annexin V-FITC，黑暗孵育15 min。再次用BB洗涤后，用500 μL BB重悬细胞球，加入5 μL碘化丙啶，用Navios流式细胞仪分析，使用Kaluza软件进行定量和图形绘制(Beckman Coulter)。
采用人凋亡抗体阵列试剂盒(ab134001, Abcam)检测细胞凋亡途径。简单地说，细胞被裂解，每个膜在4°下孵育过夜，总提取蛋白500μg。然后清洗膜，用生物素偶联抗细胞因子在4°下孵育过夜。将膜与hrp -链亲和素在室温下孵育2小时后，使用ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, USA)检测化学发光。使用Image Lab 5.2.1软件对图像进行分析。
使用GEPIA工具在TGCA的CRC, CCA, HCC和PC患者的数据集中评估ENPP2 mRNA表达(http://gepia2.cancer-pku.cn/)(参考文献:Tang, Z. et al. (2019) GEPIA2:用于大规模表达谱和交互式分析的增强web服务器。核酸研究，https://doi.org/10.1093/nar/gkz430.)。
采用GraphPad Prism 6.01软件(GraphPad software Inc.， La Jolla, CA, USA)进行组间统计学比较，采用student t检验。p < 0.05为差异有统计学意义。
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为了评估胆管癌(CCA)、肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)和胰腺癌(PC)患者的ENPP2基因表达水平，我们使用TCGA数据库的数据与肿瘤周围对照物和GTEx数据库的数据进行比较。我们发现ENPP2在CCA (p > 0.05)、HCC (p < 0.01)和PC (p < 0.01)中表达上调。相反，在结直肠癌中，与正常组织相比，ENPP2基因表达下调(p < 0.01)(图1)。
图1
使用GEPIA工具评估来自TGCA的胆管癌(CHOL)、结直肠癌(COAD)、肝细胞癌(LIHC)和胰腺癌(PAAD)患者数据集中ENPP2 mRNA的表达。将ENPP2在肿瘤组织中的表达与正常瘤周组织中的表达进行比较。ENPP2在HCC和PC中表达上调(p < 0.01)，在CCA中表达上调，但无统计学意义(p > 0.05)。在结直肠癌中，与正常组织相比，ENPP2基因表达下调(p < 0.01)。
为了评估IOA-289的抗增殖/细胞毒作用，我们用增加IOA-289浓度的方法处理胆管癌(CCA)、肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)和胰腺癌(PC)的不同细胞系。药物处理后，固定贴壁细胞，用结晶紫染色。这种筛选方法一般用于评价化疗药物或其他抗癌药物对细胞存活和增殖的影响。在我们的第一个实验中，IOA-289在添加10%胎牛血清的培养基中以10μM至50μM的浓度作用于细胞72小时。IOA-289仅在最高浓度(30至50μM，图2)下对KKU-M213、HLE、HT-29和PANC-1细胞具有显著(p < 0.05)的细胞毒作用。为了验证血清和内源性LPA的存在会干扰IOA-289活性的假设，我们用IOA-289处理了8株癌细胞，浓度从1μM到12μM，存在或不存在10%的FBS。如图3所示，即使在较低浓度(3至12μM)下，IOA-289也显示出显著的(p < 0.05)剂量依赖性细胞毒作用。这种作用在48小时后已经很明显，在72小时后得到加强。因此，IOA-289在不含胎牛血清的培养基中表现出细胞毒性作用，而在培养基中含有10%胎牛血清的培养基中则没有;这些效应在所有八种癌症模型中都是一致的，并且在每次重复(至少三次独立的实验重复)中都可以观察到。这些结果表明，IOA-289在所有模型中都具有较强的抗增殖作用，FBS干扰了IOA-289的活性。为了进一步扩展我们的初步观察结果，我们在没有或存在FBS浓度增加的情况下，用9μM IOA-289刺激HLE、KKU-M213、HT-29和Panc-1细胞。在所有细胞模型中，FBS的存在显著(p < 0.05)降低了IOA-289的活性，从FBS浓度为2%开始，而在FBS浓度为5%时，IOA-289的作用完全消失。在Panc-1细胞中，即使在最低浓度下，FBS也会阻断药物的有效性(图4)。总之，IOA-289选择性地抑制LPA，从而产生抗增殖作用，但在FBS存在时，药物的有效性被阻断，可能是由于内源性LPA的超生理水平。球体形成和克隆原性试验进一步证实了这些结果。从图5可以看出，IOA-289在抑制球状体的形成和生长方面非常有效，特别是在HLE和KKU-M213细胞系中，从低浓度的3um开始。相反，在PANC-1细胞中，只有在浓度为12 uM时才能观察到抑制作用。此外，在所分析的所有细胞系中，IOA-289以剂量依赖的方式证明了同样有效的抑制细胞从单细胞开始形成集落的能力(图6)。特别是，在KKU-M213、HLE和HT-29细胞中，至少50个细胞的集落的形成在12um浓度的IOA-289下被完全抑制。比色法测定活细胞数证实了IOA-289对细胞增殖的抑制作用。对所有细胞系的细胞周期分析表明，IOA-289处理对细胞生长的影响是导致S期停滞，在KKU-M213、HLE和Panc-1细胞中尤为明显(图7)。
图2
10 ~ 50μM IOA-289浓度对KKU-M213、HLE、PANC-1和HT-29细胞在添加10%胎牛血清的培养基中生长72 h的影响* p < 0.05
图3
IOA-289对胃肠道癌细胞增殖的抑制作用。细胞在无血清培养基或10%胎牛血清中培养，增加IOA-289浓度或与DMSO(对照细胞)孵育24、48和72小时。固定后，用结晶紫染色法评估增殖情况。* p < 0.05
图4
9μM IOA-289处理KKU-M213、HLE、PANC-1和HT-29细胞活力在不含和含2%和5%胎牛血清情况下72h的不同反应。* p < 0.05
图5
在IOA-289浓度(3、9和12μM)不存在或增加的情况下，用悬滴法孵育72 h的细胞图像。因此，通过获取10倍放大的图像并计算每次处理至少10-20个球体的面积来确定聚集体大小。经学生t检验统计分析，未经IOA-289处理的细胞与未经IOA-289处理的细胞的球体大小差异有统计学意义(*P < 0.05)。
图6
IOA-289抑制单细胞悬浮液中菌落的形成。将细胞用Matrigel接种，在不含或不含3、9和12μM IOA-289的情况下培养7-15天。在尼康Ti2显微镜下计数至少有50个细胞的菌落总数。与未处理的对照细胞相比，经IOA-289处理的细胞形成较少的菌落(蓝色条形图)。其中，9μM IOA-289和12μM IOA-289对KKU-M213和HT-29细胞的集落形成有明显的抑制作用。绿色条形图表示通过比色法获得的每种处理中活细胞的数量。各试验*P < 0.05
图7
IOA-289处理期间细胞周期期变化分析。将CRC、HCC、PC和CCA细胞培养至≥80%的浓度，然后用3、9和12μM IOA-289处理24 h。通过biocolecellular - clock?细胞周期测定法染色，观察不同的细胞周期阶段。在染料摄取和孵育后，细胞内发生明显的颜色变化，特别是与G0-G1期(黄色)、S期(绿色)、G2期和M期(蓝色)的细胞相关的颜色变化。IOA-289决定细胞周期阻滞在S期，尤其在KKU-M213、HLE和PANC-1细胞中可以观察到(*P < 0.05)。
肿瘤进展的特点是细胞运动性和侵袭性增强。为了进一步了解IOA-289对HLE、KKU-m213、HT-29和Panc-1细胞的影响，我们通过伤口愈合和跨井迁移试验评估了IOA-289对HLE、KKU-m213、HT-29和Panc-1细胞的迁移活性。将细胞接种在12孔板中，当达到融合单层时，使用移液管尖端在细胞之间产生人工间隙。48小时和72小时后观察到迁移细胞对划痕的愈合。如图8A所示，在处理24小时和48小时后，与对照组相比，IOA-289显著(p < 0.05)减少了kkumm -213细胞的细胞迁移和伤口愈合(伤口愈合减少了约50%)。在HLE细胞中，浓度为3μM的IOA-289已经足以引起40%的细胞迁移抑制，而在PANC-1细胞中，当抑制剂浓度最高(12μM)时，观察到迁移量大幅减少(60%)。在HT-29细胞中，9μM和12μM IOA-289显著抑制创面愈合(p < 0.05)。同样，transwell实验显示，IOA-289处理显著抑制了所有被测癌细胞系的迁移能力(图8B)。综上所述，IOA-289具有抑制癌细胞迁移的作用。
图8
IOA-289对细胞迁移的影响。在无血清培养基中用IOA-289处理的细胞培养物进行伤口愈合试验时，在0、24和48小时拍摄的具有代表性的相衬显微镜图像。与对照组相比，在抑制剂存在的情况下，细胞向无细胞区(概述)的迁移受到抑制。B细胞经12 μ m IOA-289处理24小时后的代表性显微镜图像显示，通过膜迁移的细胞数量减少。* p < 0.05
为了进一步探讨IOA-289对胃肠道癌细胞的作用，我们研究了其诱导细胞凋亡的作用。用IOA-289孵育后，细胞发生形态学变化，表现为细胞收缩和细胞质空泡化(图9A)。细胞凋亡的一个早期事件是质膜不对称的丧失，导致磷脂酰丝氨酸(PS)从内到外的质膜小叶易位。暴露在细胞表面的PS可以通过与Annexin v的结合来检测细胞凋亡情况。KKU-M213、HLE、HT-29和PANC-1细胞分别用增加IOA-289浓度(3、9和12μM)孵育。4 h后，细胞用FITC-Annexin V抗体染色并固定。在KKU-m213、HT-29和Panc-1中，IOA-289以剂量依赖性方式显著(p < 0.05)诱导3、9和12μM的细胞凋亡，而在HLE细胞中，9和12μM的效果相同(图9B)。为了证实这些结果，用相同浓度的IOA-289处理相同的癌细胞24小时，用流式细胞术分析细胞凋亡/坏死。KKU-M213、PANC-1、HLE和HT-29细胞的凋亡和坏死普遍增加，且呈剂量依赖性，与先前观察到的细胞增殖减少一致(图10)。此外，我们使用人凋亡抗体阵列来鉴定43种凋亡相关蛋白在12μM IOA-289处理24小时后与未处理细胞的差异表达。如图11所示，IOA-289可能通过上调Bim、Caspase-3和-8、DR6、Fas、Fas- l、p53、SMAC等促凋亡蛋白促进细胞凋亡。
图9
A倒置光镜下观察KKU-M213细胞在3、9和12μM IOA-289处理72小时后的形态学变化。通过结晶紫染色，可以观察到细胞数量随着抑制剂浓度的增加而减少。此外，细胞表现出形态变化和凋亡特征，如细胞收缩和细胞质空泡化(红色箭头)。用IOA-289处理4小时，并用Annexin V-FITC抗体染色后，荧光显微镜观察到B IOA-289诱导细胞凋亡，呈剂量依赖性。膜联蛋白V阳性细胞为早期凋亡细胞。绿色荧光(Annexin V)用ImageJ软件定量，并与DAPI蓝色荧光(细胞核)相关。* p < 0.05
图10
流式细胞术分析IOA-289对HLE、KKU-M213、PANC-1和HT-29诱导的细胞凋亡和坏死的影响。细胞在无或有抑制剂(3、9和12μM浓度)的情况下培养24小时，然后用Annexin V和碘化丙啶标记，然后用流式细胞仪分析
图11
IOA-289通过上调凋亡相关蛋白调控HLE、KKU-M213、PANC-1和HT-29胃肠道癌细胞的细胞凋亡。使用人凋亡抗体阵列鉴定了未经处理的对照细胞与12 μ m IOA-289孵育24小时的细胞中多达43种差异表达的凋亡相关蛋白。从至少3个独立实验中随机选择具有代表性的图像。如图所示，IOA-289处理后的细胞中表达不同的蛋白，临界值设为fold-change≥1,5。细胞系之间共同的上调蛋白用不同的颜色突出显示
下载原文档：https://link.springer.com/content/pdf/10.1186/s13046-023-02780-4.pdf
